2025年3月16日頒布的GB 4789.38－2025《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)　食品微生物學(xué)檢驗(yàn)　大腸埃希氏菌計(jì)數(shù)》將于9月16日正式實(shí)施。新標(biāo)準(zhǔn)對(duì)范圍、檢驗(yàn)原理、設(shè)備和材料、培養(yǎng)基和試劑、檢驗(yàn)程序、操作步驟、結(jié)果與報(bào)告多個(gè)方面都進(jìn)行了規(guī)定。由于文本內(nèi)容較多，我們不再一一贅述?，F(xiàn)將其重大變化總結(jié)如下：

重大變化1：MPN法中增加了貝類及產(chǎn)品的接種方法以及MPN表

由于牡蠣等雙殼貝類本身產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶，所以更適用于MPN法進(jìn)行檢測(cè)。在國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 16649.3-2015以及FDA BAM中對(duì)雙殼貝類產(chǎn)品均采用每個(gè)稀釋度接種5管，接種3個(gè)連續(xù)稀釋度共15管的方法。為了滿足出口需要，新標(biāo)準(zhǔn)中增加了5管接種方法，還將需要采用5管接種的范圍擴(kuò)大為全部貝類及產(chǎn)品。

重大變化2：MPN法中TBX瓊脂取代了EMB及后續(xù)的生化試驗(yàn)

從MPN法流程來(lái)看，簡(jiǎn)化了操作步驟不再進(jìn)行生化確認(rèn)，意味著大大縮短了檢測(cè)時(shí)間?？赡艽蠹視?huì)有疑問(wèn)：取消生化鑒定會(huì)不會(huì)影響結(jié)果的準(zhǔn)確性呢？我們從兩方面進(jìn)行解答：

1）EMB本身為弱選擇性培養(yǎng)基，特異性較差。再加上后續(xù)的生化實(shí)驗(yàn)，操作步驟比較繁瑣。

2）TBX是利用大腸埃希氏菌所產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸苷酶，與培養(yǎng)基中顯色底物反應(yīng)，使菌落著色來(lái)區(qū)分大腸埃希氏菌和其他非目標(biāo)菌。

標(biāo)準(zhǔn)制修訂專家在標(biāo)準(zhǔn)宣貫時(shí)也提到TBX的特異性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于EMB，同時(shí)β-葡萄糖醛酸苷酶的準(zhǔn)確度也明顯高于生化鑒定IMViC。

重大變化3：平板計(jì)數(shù)法中TBX瓊脂取代了VRBA和VRBA-MUG

如果說(shuō)MPN法中TBX瓊脂的引入提高了時(shí)效，那么平板計(jì)數(shù)法又為何用TBX瓊脂來(lái)取代同樣無(wú)需生化確認(rèn)的VRBA-MUG呢？我們要從VRBA-MUG的反應(yīng)原理說(shuō)起，VRBA-MUG同樣是利用大腸埃希氏菌所產(chǎn)生的β-葡萄糖醛酸苷酶，不同的是培養(yǎng)基中的底物為4-甲基傘形酮-β-D-葡萄糖苷（MUG）。大腸埃希氏菌能夠分解培養(yǎng)基中的MUG，使4-甲基傘形酮游離出來(lái)，在長(zhǎng)波紫外光下產(chǎn)生藍(lán)色熒光。因?yàn)榫溆?jì)數(shù)依賴于熒光的觀察，所以實(shí)際操作時(shí)可能會(huì)遇到一些問(wèn)題。

1）紫外燈：觀察熒光需要合適的紫外燈，不同紫外燈下觀察到的熒光有明顯差異。所以配置時(shí)需要關(guān)注波長(zhǎng)、功率等。

兩臺(tái)不同紫外燈觀察到的熒光強(qiáng)弱有差異

2）計(jì)數(shù)：4-甲基傘形酮具有水溶性，即使在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的適宜菌落數(shù)的平板上，熒光擴(kuò)散很容易將非目標(biāo)菌也染上熒光，造成計(jì)數(shù)困難。

    不同目標(biāo)菌數(shù)量時(shí)顯現(xiàn)的熒光情況

3）假陰性：2012版標(biāo)準(zhǔn)接種方式為先傾注VRBA再覆蓋VRBA-MUG，不能直接接觸到VRBA-MUG的目標(biāo)菌熒光不明顯，可能導(dǎo)致假陰性。

4）試驗(yàn)器皿的干擾：要求材質(zhì)良好且潔凈無(wú)殘留。因?yàn)槟承┢髅蟛馁|(zhì)本身含有熒光物質(zhì)，或者清洗時(shí)殘留的洗滌劑也可能會(huì)有熒光，容易造成假陽(yáng)性結(jié)果。

5）標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)照：操作時(shí)要求使用陽(yáng)性目標(biāo)菌和陰性菌作為對(duì)照，以保證結(jié)果的有效性。

綜上所述，VRBA-MUG在實(shí)際應(yīng)用中存在諸多難點(diǎn)，而TBX瓊脂具有良好的特異性，單純從菌落顏色來(lái)進(jìn)行判定，不僅無(wú)需配置特定設(shè)備，而且觀察簡(jiǎn)單明了，也減少了判讀誤差。

TBX瓊脂是胰蛋白胨膽鹽 X-葡萄糖醛酸苷（TBX）瓊脂的簡(jiǎn)稱，原理是利用大腸埃希氏菌所產(chǎn)生特異性的β-葡萄糖醛酸苷酶，分解TBX瓊脂中的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖醛酸苷底物，形成藍(lán)綠色菌落，從而區(qū)分目標(biāo)菌和其他菌。

--注：絕大多數(shù)大腸埃希氏菌具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性。但大腸埃希氏菌 O157等菌株沒(méi)有β-葡萄糖醛酸苷酶活性。另外，腸桿菌科內(nèi)一些志賀氏菌、沙門(mén)氏菌等菌株也具有β-葡萄糖醛酸苷酶活性。

接著看看分別用標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證目標(biāo)菌回收率、非目標(biāo)菌特異性及選擇性，以及使用樣品添加、質(zhì)控樣品及自然污染樣品驗(yàn)證其實(shí)際應(yīng)用的結(jié)果。

1）標(biāo)準(zhǔn)菌株試驗(yàn)：不同菌株生長(zhǎng)情況如表1所示。

--大腸埃希氏菌在TBX瓊脂上菌落形態(tài)為藍(lán)綠色且菌落中心顏色深，回收率PR均大于0.7（質(zhì)控依據(jù)參照VRBA瓊脂）；

--大腸埃希氏菌O157由于不產(chǎn)生β-葡萄糖醛酸苷酶，則表現(xiàn)為無(wú)色菌落；

--多數(shù)非大腸埃希氏菌的腸桿菌科細(xì)菌呈現(xiàn)無(wú)色菌落；

--銅綠假單胞菌由于可產(chǎn)生藍(lán)綠色素，呈現(xiàn)綠色擴(kuò)散菌落，可以與大腸埃希氏菌進(jìn)行區(qū)分；

--沙門(mén)氏菌中亞利桑那沙門(mén)因具有β-葡萄糖醛酸苷酶的活性會(huì)引起誤判，但沙門(mén)作為致病菌更應(yīng)該被監(jiān)測(cè)，所以也算是誤打誤撞可以一網(wǎng)打盡；

--枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌等革蘭氏陽(yáng)性菌株在TBX瓊脂上被完全抑制。

表1：不同標(biāo)準(zhǔn)菌株在TBX瓊脂上生長(zhǎng)情況

2）模擬實(shí)際應(yīng)用：

      將TBX瓊脂應(yīng)用于樣品（含陽(yáng)性添加）及質(zhì)控樣品的檢測(cè)，使用平板計(jì)數(shù)法進(jìn)行試驗(yàn)，大腸埃希氏菌均呈現(xiàn)出鮮明的藍(lán)綠色，與非目標(biāo)菌容易區(qū)分，觀察計(jì)數(shù)非常輕松。而高污染背景的下水道涂抹（直接劃線）和廁所水樣品（平板計(jì)數(shù)法）用TBX瓊脂檢測(cè)時(shí)，也能呈現(xiàn)出很好的選擇性。

        因此，TBX瓊脂無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)菌株試驗(yàn)還是模擬實(shí)際應(yīng)用，不僅操作簡(jiǎn)單、計(jì)數(shù)簡(jiǎn)便，其生長(zhǎng)率、特異性和選擇性都呈現(xiàn)很好的效果。